MECHANISTIC FEATURES OF RNA-DIRECTED MOLECULAR ASYMMETRY OF AMINO ACIDS

Koji Tamura1,2,3
1Department of Biological Science and Technology, and 2Research Institute for Science and Technology, Tokyo University of Science, 2641 Yamazaki, Noda, Chiba 278-8510, Japan 3PRESTO, Japan Science and Technology Agency, 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama 332-0012, Japan
E-mail: koji@rs.tus.ac.jp
(Received April 27, 2011; Accepted July 27, 2011)

(Abstract)

     Chiral-selective aminoacylation of an RNA minihelix (progenitor of the modern tRNA) could provide a crucial clue to solve the origin of homochirality in a biological system. In this reaction, an amino acid donor (aminoacyl phosphate oligonucleotide) is placed in close proximity to minihelix with the help of a bridging oligonucleotide, which possesses sequences complementary to both donor nucleotide and single-stranded NCCA of minihelix, to accomplish the chiral (L-amino acid)-selective aminoacylation of the minihelix. Here, we propose a molecular mechanism of chiral selectivity based on the mutational analysis of the donor and bridging nucleotides. The selectivity for L-amino acids is dependent on the stereochemistry of RNA. Due to cation coordination and sugar pucker, the side chain of D-amino acids is brought much closer to the terminal adenosine of the minihelix, thereby causing steric hindrance of the D-amino acids during amino acid transfer from the donor nucleotide to minihelix. This mechanism completely explains the result of the original chiral-selective aminoacylation experiment without any contradictions. This selective process may have determined the homochirality of L-amino acids in the putative RNA world.

This article is dedicated to the memory of Dr. Kaoru Harada.

(Keywords)
homochirality; amino acid; RNA minihelix; aminoacylation; stereochemistry; extended double helix


RNAによるアミノ酸の分子非対称性選択の作用機構

田村浩二1,2,3
1東京理科大学 基礎工学部 生物工学科
2東京理科大学 総合研究機構 〒278-8510 千葉県野田市山崎2641
3科学技術振興機構 さきがけ
〒332-0012 埼玉県川口市本町4-1-8
E-mail: koji@rs.tus.ac.jp

1.はじめに

    生命はDNAの遺伝情報を翻訳したタンパク質が機能することで成り立っている[1,2].タンパク質はアミノ酸がアミド結合(ペプチド結合)した構造を持ち,通常,20種類の側鎖から成る多様な化学的性質と立体構造から生み出される触媒能力は,他の人工物の追随を許さない.タンパク質を構成するアミノ酸はα-アミノ酸であり,立体化学的には,L-アミノ酸,D-アミノ酸の2種類が同等に存在できるはずであるが,不思議なことに,リボソームが作り出す天然タンパク質は,すべてL-アミノ酸から構成されている[3,4].
     素粒子が持つ本質的な性質[5],宇宙空間における円偏光の分布[6],自己不斉触媒効果[7-9]などの立場から,アミノ酸のホモキラリティーの起源について,さまざまな議論が行われているが,地球上の生命に見られるtRNAのアミノアシル化の起源を探るモデル実験から,アミノ酸のホモリラリティーの謎の解明に関係した重要な発見があった.それは,RNAミニヘリックスのキラル選択的アミノアシル化であり,RNAとアミノ酸がはじめて出会うステップにおいて,アミノ酸のホモキラリティーが決定された可能性を強く示唆するものである[10-14].
     ホモキラリティーの起源に関わる問題は,非常にデリケートであり,確定的な結論に至るには,まだ多くの証拠収集の必要性はあるものの,RNAミニヘリックスのキラル選択的アミノアシル化に見られるキラル選択性は,実験系に関わる現実の分子(RNAとアミノ酸)が繰りなす分子認識の結果の産物である.本稿では,どのようなメカニズムで,実際にL-アミノ酸が選択されているのかについて,立体化学に基づいた議論を行いたい.

2.RNAミニヘリックスのキラル選択的アミノアシル化

    キラル選択性の議論をする前に,問題となっているモデルそのものについて,簡単に説明しておく必要がある.このモデルは,全生物に共通に見られるtRNAのアミノアシル化反応がどのようにして進化してきたのかを明らかにする目的で考案された[10-14].tRNAのアミノアシル化は,DNAをコピーしたmRNA上の遺伝情報を,タンパク質に翻訳する際の鍵となる反応である[15,16].現在の生物系においては,20種類のアミノ酸に対応したtRNAと,それぞれのtRNAに対応するアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)というタンパク質が存在し,aaRSが間違いなくアミノ酸を対応するtRNAに結合させている(tRNAのアミノアシル化)[15,16].そして,最終的にアミノアシル化されたtRNAがリボソーム上でアミノ酸を繋げることによって,タンパク質が生成されることになる[1,2].生命進化の初期には,RNAワールドというものが存在していたと考えられており[17-19],RNAワールド仮説では,次のステップとしてタンパク質との関係が生まれてくると考えられる.従って,tRNAのアミノアシル化がタンパク質合成系の確立の糸口になった可能性がある.
     原始アミノアシル化モデルでは,tRNAと同様にミニへリックスにも存在する一本鎖のCCA配列と,アミノアシル-リン酸-オリゴヌクレオチドの双方の配列に相補的な配列を有する架橋分子を用い,アミノ酸をオリゴヌクレオチドのリン酸基からミニヘリックスの3′末端のアデノシンのOH基へと移動させている[10-14].アミノアシル-リン酸-オリゴヌクレオチドは,現在のアミノアシル化反応の中間体であるアミノアシルAMPをミミックした分子であり,この反応はエネルギー的にダウンヒル反応である[20].このモデル系において,ミニヘリックスのアミノアシル化はアデノシンの3′-OHの部分に,キラル選択的(L-アミノ酸優位)に起こり,L-アミノ酸はD-アミノ酸に比べて約4倍も効率的にアミノアシル化されることが明らかになった(Fig. 1)[10-14].



Figure 1. (A) Scheme for aminoacylation of an RNA minihelix with an amino acid donor oligonucleotide (acyl phosphate oligonucleotide) and a bridging oligonucleotide. Watson-Crick (dT-A) pairing was replaced with wobble base pairing (dT-G) at the position closest to the amino acid attachment site. (B) Introduction of the dT-G wobble base pair causes distortion of the double helix and shifts the position of CH3.

3.立体障害が反応に及ぼす影響

    一連のモデル実験に用いたアミノアシル-リン酸-オリゴヌクレオチドにおいて,アミノ酸は単結合を介してリン酸基と結合している.従って,trans-gausche配座に基づく何らかの選択性が存在する可能性はあるものの,このアミノ酸は,比較的自由に,結合軸の周りを回転できるはずである.この状況で,何がL-アミノ酸の優位性を生み出しているのか?
     このような単結合を介した各部分の立体配置の解明を目指して,分子動力学を行ってもなかなか真実は得られない.要するに,仮定すべき介在分子(イオン,水)の条件などで,どのようにでも結果は違ったものになってしまう.では,どうしたら良いか?論より証拠,実際に実験を行って,その結果から物事を議論するのが一番である.
     アミノアシル-リン酸-オリゴヌクレオチドによるRNAのアミノアシル化において,キラル選択性に影響を与えているであろう,アミノ酸隣接部位のヌクレオチドのコンフォーメーションを変化させることで,どのような影響が出るのかを見れば,反応メカニズムの解明への手がかりになるかもしれない.上述のモデルシステムにおいて,アミノ酸が結合している5′側のヌクレオチドはdTである.この相手側はAであり,ワトソン・クリック型の相互作用をしている.従って,塩基対としてはdT-Aというものになる.そこで他の部分はまったく同じにして,この塩基対のみをdT-Gというウォブル塩基対にして実験を行った.dT-Gに変更することで,塩基対の端に歪みが生じ,この歪みのために引き起こされた微小な構造変化によって,反応にどのような影響が出るのかを観察した(Fig. 1).その結果,驚いたことに,D-Alaのアミノアシル化にはほとんど影響を与えず,L-Alaのアミノアシル化を著しく減少させた(Fig. 2).つまり,dT-Gの導入によって,L-アミノ酸は相対的にD-アミノ酸よりもアミノアシル化されなくなったのである.結果として,LとDのキラル選択性が逆転したことになる[21,22].
     dT-Gの導入により,チミンのメチル基は二重らせんの外側へ張り出すことが考えられる(Fig. 1).L-Alaのアミノアシル化の減少は,このチミンのメチル基とL-Alaのメチル基との立体障害であると考えられる.この一見,矛盾するキラル選択性逆転の結果が,アミノアシル化の際のアミノ酸の立体配置の決定に大きな意味を持つことになった.dT-Gの導入によるL-Alaのアミノアシル化の活性低下から,L-Alaのメチル基はチミンのメチル基の近くに位置していることと,D-Alaのメチル基はアミノアシル化の場であるミニへリックスに近い位置に存在していることが予想される(Fig. 3)[21,22].
     オリジナル反応におけるキラル選択性は,Alaのアミノ基をアセチル基でブロックした場合においても不変であった(L>D)[21].フリーのGly,および,N-アセチル-Glyの場合にNa+イオンが同じようにbidantate modeで配位することが示されており[23],そのような配位状態をAlaの系に当てはめれば,Ala(およびN-アセチル-Ala)のアミノ基とカルボニル酸素との間に,Na+イオンがbidantate modeで配位していると考えられる.更に,DNAポリメラーゼと基質の構造解析の結果からも明らかなように,カルボニル酸素とリン酸基の酸素間にはMg2+が配位している可能性が高く[24,25],これらのカチオンの配位による立体障害を考慮すると,アミノ酸のアミノ基の部分は,二重らせんの外側に配置されていると考えることができる(Fig. 4).この配置はL-Ala,D-Alaの側鎖のメチル基が,それぞれ,ミニへリックスから離れた状態,および,ミニへリックスに近い状態に位置していることと矛盾していない(Fig. 3).また,この配置において,dT-AからdT-Gへの変異に伴い引き起こされる,チミンのメチル基の張り出しによるL-Alaのメチル基との立体障害に関しても,矛盾なく説明できる(Fig. 3)[22].
     チミンのメチル基の張り出しによるL-Alaのメチル基との立体障害に関しては,チミンをウリジンに換えたdU-Gタイプで,L-Alaのアミノアシル化活性が元に戻ることからも信憑性が得られる(Fig. 2).一方,dT-Gと同じようにウォブル塩基対を形成し,dT-Gと同様なチミンのメチル基の張り出し効果を期待できるペアとしてdT-I(I:イノシン)がある.dT-Gウォブル塩基対において,Gの1位のNHと6位のC=OがdTの2位のC=Oと3位のNHとそれぞれ水素結合を形成することで,Gの2位のアミノ基が二重らせんのマイナーグルーブ側に張り出し,通常のワトソン・クリック塩基対に比べて,らせんが歪むことになる.IはGの2位のアミノ基を水素原子で置き換えたものであり,dTに対する水素結合形成の観点からは,dT-GとdT-Iはまったく同様なウォブル塩基対を形成する.しかしながら,dT-Iの場合は,dT-Gの場合のような,L-Alaのアミノアシル化の減少は見られなかった(Fig. 2)[21,22].このdT-GとdT-Iの場合のアミノアシル化の結果の違いは何を意味するのだろうか?



Figure 2. Chiral preferences of Ala aminoacylation by using Watson-Crick (dT-A) and wobble base pairs placed closest to the amino acid attachment site. The different font sizes correspond to relative activities of aminoacylation.



Figure 3. Schematic representation of the stereochemical positioning of (A) L-Ala and (B) D-Ala. The positioning of the CH3 of Ala relative to that of the 3′-OH of the minihelix and to that of the CH3 of thymidine deterimines the chiral preference during aminoacylation.



Figure 4. Bidentate coordination of Na+ (A) between the carbonyl and amino groups of Ala and (B) between the 2 carbonyl O-atoms of N-acetyl-Ala.

4. リボースのパッカリングとアミノアシル化

    リボースを構成するフラノース5員環は平面構造ではない.平面から飛び出している原子のうち,C5′と同じ側にあるものをendoと呼び,反対側にあるものをexoと呼んでいる[26].これで,糖のパッカリングを定義する.リボースの2つの主なパッカリング様式は,C2′-endoおよびC3′-endoである(Fig. 5)[26]. tRNAのアンチコドンの修飾ウリジンの種類により,xo5U 型の修飾はC2′-endo型を安定化し,xm5U 型の修飾はC3′-endo 型を安定化することが知られている[27,28].温故知新,このようなパッカリングによる違いが,前節で述べた,dT-GとdT-Iの場合の結果の違いに関係しているのではないか?これを明らかにするために,Alaがリン酸基を介して結合しているdTの糖の2′の位置にO-CH3基を導入することを試みた(Fig. 6)[21,22].2′-O-CH3基の導入により,糖のパッカリングがC3′-endo型に固定されることが知られている(Fig. 6)[29].このT(2′-O-CH3)-Gという塩基対の場合,dT-Gに見られたL-Alaのアミノアシル化の低下は見られず,これらはdT-GのdTのパッカリングがC3′-endo型ではなく,C2′-endo型であることを示唆している(Fig. 6)[21,22].
     C2′-endo型とC3′-endo型の違いの1つに,C4′-C5′結合のリボース環に対する傾きの違いが挙げられる[26]. C2′-endo型の場合,C4′-C5′結合は環に対して立った状態であるのに対し,C3′-endo型の場合,C4′-C5′結合は環に対して寝ている(Fig. 5)[26].C5′はリン酸基を介してAlaに結合しているので,最終的なAlaの位置というものは当然ながらC4′-C5′結合の有り様によって影響される.C3′-endo型であるT(2′-O-CH3)-Gの場合,O-C4′-C3′で形成される面に対するC4′-C5′軸の角度は,C2′-endoの場合よりも大きいために,L-Alaのメチル基の位置はチミンのメチル基と立体障害にならないぐらい遠くに位置しているに違いない.これに対し,dT-GでL-Alaのアミノアシル化が減少したのは,L-Alaのメチル基とチミンのメチル基のクラッシュによるものであり,dT-GのdTのパッカリングがC2′-endo型のため,C4′-C5′結合は環に対して立っており,両メチル基間の距離を小さくさせている可能性が考えられる(Fig. 6).T(2′-O-CH3)-GがO-CH3基が持つコンフォーメーションの制約のためにC3′-endo型を固定するように,dT-G塩基対におけるdTのパッカリングがC2′-endo型を取るためには,何らかの条件が付されなければならない.dTのC2′には水素原子が2つ結合しているに過ぎないため,その周りの立体障害は少ない.一方,C3′には酸素原子が結合しており,ホスホジエステル結合の形成に寄与している.また,dT-G塩基対のGに目を転じると,マイナーグルーブ側に張り出した2位のアミノ基が存在しており,このアミノ基とdTの3′-Oの間に構造的な制約を課せば,dTのコンフォーメーションはC2′-endo型になると考えられる.実際,NMRによるdT-dGを含むオリゴヌクレオチド構造が明らかにされているが,この時のdTのパッカリングはC2′-endo型で,dTの3′-Oとグアニンの2位のアミノ基のHの距離は7.2Åである[30].これは水が1分子入り込み,水素結合を形成するのに最適の距離である.この水分子による水素結合がC2′-endo型のコンフォーメーションを固定している可能性がある(Fig. 6).このdT-dGを含むオリゴヌクレオチドのパッカリングや各原子間の距離の情報は,ドナーアミノ酸が結合した部位にdT-Gを有するオリゴヌクレオチドを用いたアミノアシル化モデルでのキラル選択性を説明する重要なデータに成り得る.
     いずれにせよ,ワトソン・クリック型の相互作用を介して二重らせん様構造を形成しているこのモデル反応において,L-アミノ酸の側鎖はミニヘリックスに対して反対側に位置し,D-アミノ酸の側鎖はミニヘリックスの近くに位置しているということが明らかになった.このために,D-アミノ酸の側鎖の立体障害によって,D-アミノ酸の移動が阻害されているということになる(Fig. 3).



Figure 5. Schematic representation of typical puckering of the ribose ring (Saenger, 1984).





Figure 6. Possible differences in the positioning of L-Ala based on differential ribose puckering with dT-G and T(2′-O-Me)-G at the position closest to the amino acid attachment site.

5. おわりに

    生物界のホモキラリティーの起源は,生命の根本的な謎の1つである.この問題の解明に,さまざま説明がなされているが,現実の生命の根幹であるタンパク質合成系の最大のイベントであるtRNAのアミノアシル化の過程に,その謎を解く鍵があるということは,極めて重要であるだろう[10-14].生命の進化を考える上でも,進化の初期の段階でRNAが中心となったRNAワールドと呼ぶべき世界があったであろうことは間違いないと思われる(RNAワールドが生命の起源であるかどうかは別として).本稿で示したアミノアシル化過程で見られるキラル選択性は然るべき立体化学的解釈に基づいており,現時点で,筆者がこの実験結果を矛盾なく説明する方法は,これ以外に考えられない.生命は,原始地球上で生成された様々なブロック分子が化学反応サイクルを生み出すことでスタートした可能性が考えられる.生命の起源の謎を解明するためには,ブロックとなる小分子がどのように生成されたのかという過程と,それらがどのように相互作用を開始し始めるのかという過程の,2つの側面からアプローチする必要がある.前者に関して,原田馨先生が残された功績は非常に大きい[31-33].しかし,今後の課題は,間違いなく後者の問題であり,生命の本質の解明のために更なる研究の発展が求められるであろう.

謝辞

    The Scripps Research InstituteのPaul Schimmel博士には有益な助言を賜り,また,科学技術振興機構・さきがけ(RNAと生体機能),および,文部科学省・私立大学戦略的研究基盤形成支援事業による助成をいただいた.ここに感謝の意を表したい.

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