ABSORPTION SPECTROSCOPY OF AMINO ACIDS IN ULTRAVIOLET TO SOFT X-RAY REGION

Yudai Izumi
Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3-11, Tsurukabuto Nada-ku, Kobe, 657-8501, Japan
E-mail: izumi@radix.h.kobe-u.ac.jp
(Received July 29, 2008; Accepted August 22, 2008)

(Abstract)

Amino acids have been detected from some meteorites. This fact suggests that these amino acids (or its precursors) are produced in space and the possible energy sources should be vacuum ultraviolet (VUV) light, X-ray, high energy particles and so on. To understand the interactions between biomolecules and those energy sources quantitatively, absorption cross section is important information. However, the absorption cross section of biomolecules within the range from VUV to soft X-ray region was hardly reported. Recently our group succeeded to determine the absorption cross section of some amino acids (glycine, alanine, phenylalanine and methionine) in ultraviolet to soft X-ray region (5 nm ≤ wavelength ≤ 350 nm; 3.5 eV ≤ photon energy ≤ 250 eV). Herein, I am going to briefly review the experimental and analytical techniques for the measurements of the absorption cross section, which were recently established in our group.

紫外~軟X線領域におけるアミノ酸の吸収スペクトル測定

泉 雄大
神戸大学大学院 人間発達環境学研究科 博士課程後期課程 人間環境学専攻 〒657-0051 神戸市灘区鶴甲3-11 神戸大学人間発達環境学研究科中川研究室
FAX:078-803-7761
E-mail:izumi@radix.h.kobe-u.ac.jp

1.はじめに

     隕石からアミノ酸が検出されたこと[1-3]は,宇宙でアミノ酸(前駆体)の合成反応が起こったことを示している.宇宙環境で無機物からアミノ酸(またはその前駆体)が生成するエネルギー源として,電磁波の中でも特にエネルギーの大きな真空紫外線や軟X線が有力な候補として挙げられるだろう.また実際,太陽から放射される幅広い電磁波スペクトルにも真空紫外線[4]や軟X線[5]が含まれていることは,衛星などを用いた観測により確認されている.そこで,われわれのグループでは, (1)アミノ酸は固体としてすでに存在している,(2)すべてのアミノ酸は遊離の状態である,(3)L体とD体は等量存在している,という仮定を立て,宇宙空間におけるアミノ酸生成後の反応過程を模擬するために,アミノ酸の固相膜に電磁波を照射して観察する研究を続けてきた.その中で,真空紫外線もしくは軟X線によって誘起されるグリシンの化学進化[6]や,アスパラギン酸の光分解過程ではラセミ化が起こらないこと[7]などを報告してきた.これらの研究において定量的な議論を成功に導くためには,一見,生命の起源の研究を進めていく上では遠回りにも思われる真空紫外線および軟X線領域の吸収スペクトルを正確に測定することが不可欠であった.
     光によって誘起される反応には,光が吸収される過程が必ず含まれる.したがって,光によって誘起される反応を定量的に議論するためには,光吸収光量の決定が必要である.しかしながら,真空紫外線から軟X線領域のアミノ酸の光吸収光量を決定する鍵である固体状(膜状)アミノ酸の光吸収スペクトルの報告例は少なかった.しかも,そのほとんどは膜の厚さに依存する相対値であり[8],吸収光量の決定には向かないものであった.そのため,われわれのグループでは,10年ほど前から固相アミノ酸の光吸収スペクトルを紫外領域で膜厚に依存しない値=絶対値として測定する(以下,絶対値測定と呼ぶ)ことに挑戦してきた.その初期の成果は既に報告されている[9, 10]ので,本稿では,測定範囲を紫外線領域を超えて軟X線領域(約5 nm, 約250 eV)にまで広げることに成功した最近の成果[11]を紹介する.
     読者の中には,宇宙で化学進化に寄与したエネルギー源の主役は光ではなく,高速で運動する荷電粒子であると考える方がおられるかもしれない.しかし一方で,放射線化学における光学近似[12]によると,高速荷電粒子がごくわずかな時間に与える電場揺動は,広い波長(エネルギー)範囲にわたって分布した光子と分子内の電子との双極子相互作用とほぼ等価であることが知られている.すなわち,高速荷電粒子と物質との相互作用は,光子と物質との相互作用として近似的に理解できる.したがって,荷電粒子とアミノ酸との相互作用を考える上でもアミノ酸の光吸収スペクトルの絶対値測定は非常に重要である.
     2節では,本稿で述べる分光法と結果を専門外の方が理解するために必要な知識を簡単に述べる.「ランベルト-ベール(Lambert-Beer)の法則」と聞いて,関係式が思い浮かぶ方は読み飛ばしていただいて差し支えない.3節では,実験方法と結果について述べ,4節では実験によって得られた光吸収断面積(絶対値)の検証方法について述べる.

2.ランベルト-ベール(Lambert-Beer)の法則

 サンプルに波長λ,強度I0 (λ)の光が入射した場合を考える.このとき,サンプルによって光の一部が吸収されたならば,透過してくる光の強度はI (λ)に減衰する.この場合には,入射光強度I0 (λ)と透過光強度I (λ)の間にLambert-Beerの法則と呼ばれる以下の関係式が成り立つ.

サンプルが溶液の場合


サンプルが固体の場合





ここで,Cは溶液のモル濃度[mol dm-3],Lはセルの長さ[cm],εは溶液の吸収の強さを示す物理量でモル吸光係数[mol-1 dm3 cm-1]と呼ばれる.また,Nはサンプル内の分子の数密度[molecules cm-3],Tはサンプルの厚さ[cm]である.σは吸収断面積[cm2],μは線吸収係数[cm-1]と呼ばれ,これらも吸収の強さを表すのに用いられる物理量である.ここで書いたそれぞれの単位は慣習的に用いられているものである.お気付きの方もおられるかと思うが,溶液と固体の場合で異なる式を用いるのも慣習によるもので,溶液と固体で式を分ける本質的な意味はない.式(1)~(3)を変形すると,次の式(4)~(6)を得ることができる.

 



式(4)~(6)の左辺は,入射光強度を透過光強度で割り(すなわち,透過率の逆数),常用対数をとったものであるが,この値を吸光度(Absorbance; ABS)や光学密度(Optical Density; OD)と呼ぶ.多くのスペクトル測定では,この値が吸収スペクトルとしてプロットされる.しかしながら,右辺に濃度や厚さといったサンプルに依存するファクターを含むために,測定ごとに強度が変化し得る相対値である.
     したがって,定量的な議論にはモル吸光係数ε(λ)や吸収断面積σ(λ),線吸収係数μ(λ)といった物質固有の普遍的な量(絶対値)で吸収スペクトルを得る必要がある.すなわち,入射光強度と透過光強度を測定するだけでは不十分で,さらにサンプルに依存するファクターを決定しなければならない.溶液の場合には,濃度やセルの長さは既にわかっているので,直ちにモル吸光係数ε(λ)を決定することができ,サンプルに依存しない絶対値で吸収スペクトルを得ることができる.一方,われわれのターゲットは固体であるから数密度Nや厚さTを決定しなければならない.これらの決定は,溶液の場合ほど簡単ではない.次節で,数密度Nと厚さTの決定法および入射光強度や透過光強度の測定法を詳しく述べる.

3.実験方法と結果

3.1 基板の作成
     本研究のような透過光を測定する実験では,試料をのせる基板の選定が重要である.なぜなら,真空紫外線~軟X線領域では,基板自身が光を吸収するからである.一般的な紫外線領域の光学測定で用いられる基板(例えば,溶融石英,MgF2,LiFなど)はかなり厚い(といっても1 mm程度であるが)ため,基板自身の吸収のために,実質的に測定可能な波長域下限は,最も短いLiFの場合で105 nm程度である.本研究では,105 nmよりも短波長領域で測定することが目的であるから,これらの基板は利用できない.
     そこで,われわれは透過型電子顕微鏡観察で試料の支持膜としてよく用いられるコロジオンに注目した.コロジオンは,硝化度の低いニトロセルロースをアルコールとエーテルの混合溶液に溶かしたもので,溶媒を蒸発させると水に溶けない薄膜(コロジオン膜)を簡単に作成することができる.コロジオン薄膜自身も真空紫外線や軟X線を吸収するものの,一般的な基板と比べてはるかに薄くできる(わずか数nm)ので,基板自身の吸収を小さくすることが可能である.すなわち非常に薄いコロジオン膜の作成に成功したことが,波長110 nm以下での絶対値測定を可能にした大きな要因である.
     コロジオン膜の作成法は以下の通りである.タングステンメッシュを蒸留水中に沈め,水面にコロジオン溶液を滴下した.溶液に含まれる有機溶媒を十分飛ばした後で,容器の下部から排水し,水面にできた薄い膜をメッシュに付着させた(以下,コロジオン基板と呼ぶ).水分が残っているとアミノ酸が溶解してしまうため,十分乾燥させた後に用いた.
3.2 アミノ酸蒸着膜
     光吸収スペクトルを絶対値測定するためには,膜の厚さが均一であることが必要である.そこで,われわれのグループはアミノ酸の真空蒸着膜を用いた.
     ニクロムヒーターの上にカプトン箔を置き10-3 Pa程度の真空中でアミノ酸粉末を加熱した(カプトン上の温度は最大で80℃程度であった).アミノ酸粉末を昇華させコロジオン基板の上に蒸着膜を作成した. アミノ酸は比較的蒸着が簡単なグリシン(Gly),L-アラニン(Ala),L-フェニルアラニン(Phe),L-メチオニン(Met)を用いた.膜厚は水晶振動子の膜厚モニターを用いて10 nm程度に調節した.
3.3 相対スペクトルの測定
     分光測定は,自然科学研究機構・分子科学研究所UVSORのBL5B,BL7Bにおいて行った.測定波長範囲は,それぞれ5-40 nm(約31-250 eV),30-300 nm(約4-40 eV)であった.ここで,コロジオン膜自身の光吸収を除去し得られた吸収スペクトルを補正する必要がある.そこで,まずコロジオン膜のみを透過してきた光の強度I0(λ)を測定した.続いて,アミノ酸を蒸着したコロジオン膜を透過した光の強度I(λ)を測定した.測定したI0(λ)とI(λ)を用いて,吸光度を求め,膜厚に依存する相対値としてアミノ酸の吸収スペクトルを得た.一例としてL-MetのスペクトルをFig. 1に示す.


Fig. 1. Relative absorption spectrum of L-methionine (Met).


3.4 絶対値の決定
     膜厚などの決定は,UVSORでの測定終了後に神戸大学で行った.溶融石英基板にアミノ酸の蒸着膜を作成し,市販の分光器(VM-504, Acton)を用いて,3.3と同様の方法で165-350 nm(約3.5-7.5 eV)にわたって吸光度を求め,相対値として吸収スペクトルを得た.測定終了後,石英基板上のアミノ酸の蒸着膜に蒸留水を滴下して,アミノ酸水溶液として回収した.得られた水溶液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析し,ピークエリアから蒸着膜内の分子数nを決定した.分子数nを蒸着膜の底面積Sで割ったものは,数密度Nと膜厚Tの積に等しいことから,式(5)から式(7)が得られる.

 

 



ここで,底面積Sは既知であるから,nを用いることでαは既知の定数となる.したがって,相対値スペクトルをα倍して膜厚に依存する項を相殺することによって,165-350 nmにわたって吸収断面積σ(λ)を決定した.この操作によって165-350 nmにわたる吸収スペクトルを膜厚というパラメータを含まない絶対値として得ることができた.
     次に,UVSORで測定した吸光度(相対値スペクトル)と神戸大学で測定した絶対値スペクトルを比較して,UVSORで測定したスペクトルの吸収断面積を求めた.Fig. 2にUVSORで測定したL-Metの相対スペクトル(スペクトルA)と神戸大学で測定した165-350 nmにわたるL-Metの絶対値スペクトル(スペクトルB)を示す.例えば175 nmでは,スペクトルAの光学密度(すなわちlog10 I0/I)は0.48であり,スペクトルBの吸収断面積σ(λ)は53×10-18 cm2であった.スペクトルAとスペクトルBは同じ物質のスペクトルであるから,2つのスペクトルの絶対値は一致しなければならない.したがって,2つのスペクトルの縦軸を比較することで,HPLC分析の結果によらなくとも,スペクトルAにかけるべき定数αは1.1×10-16 cm2であると決定できる.よって,1.1×10-16 cm2をスペクトルAにかけることで,5-350 nmにわたってL-Metのスペクトルを絶対値として得ることができた.同様の方法で,残りのアミノ酸に関しても5-350 nmにわたって絶対値で吸収スペクトルを得た.これらのスペクトルをFig. 3に示す.


Fig. 2. Absorption spectra of L-Met. Thin solid line (A): relative absorption spectrum of L-Met on collodion film measured at UVSOR (left axis); thick solid line (B): absolute absorption spectrum of L-Met on quartz plate measured at Kobe University (right axis).




Fig. 3. Absolute absorption spectra of glycine (Gly), L-alanine (Ala), L-phenylalanine (Phe), L-Met.


4.絶対値スペクトルの検証

     3節で述べたように,本研究では,165-350 nmまでの狭い領域の吸収スペクトルで5-350 nmまでの広い領域のスペクトルを較正した.そこで,紫外線~軟X線領域の吸収スペクトルの絶対値の検証法[例えば13-17]に用いられているThomas-Reiche-Kuhnの総和則(T-R-K総和則)を用いて吸収断面積の検証を試みた.
     T-R-K総和則は振動子強度の総和則とも呼ばれ,(8)式に示すように原子や分子などの電子系の2つのエネルギー準位l, k間の光吸収による遷移について,その振動子強度flkのすべてのl, kについての和と系の全電子数Zが等しくなる[18]という法則として知られている.

 

 



ただし,振動子強度flkは古典的振動子や束縛状態で定義されるもので,本研究のような紫外から軟X線にわたる広範囲のスペクトルに適用する場合には,(9)式で示されるような振動子強度分布df /dEの全エネルギー(波長)にわたる積分値と系の全電子数が等しくなるという,より一般化したT-R-K総和則を用いるべきである[12].振動子強度分布に関する詳しい説明は,文献[19]などを参照していただきたい.



 



     本研究で測定した吸収断面積σ(E)と振動子強度分布df /dEとの間には式(10)のような関係があり[20, 21],吸収断面積がわかれば直ちに振動子強度分布が得られる.



 



ここで,βは定数(1.098×10-16 [cm2 eV])である.ただし,このときは,吸収断面積σ(E)はcm2単位,振動子強度分布df /dEはeV-1単位であることに注意が必要である.また光子のエネルギーEと波長λ の間には,E = hc/λの関係がある.ここで,hはプランク定数,cは光速度である
.      式(10)を用いて吸収断面積を振動子強度分布に変換し,3.5-250 eV(5 nm-350 nm)にわたって積分した結果と,3.5-250 eVの範囲で遷移に関わる電子の総和を計算した(Table. 1).本研究の測定範囲のエネルギー領域は,炭素のK殻吸収端よりも低エネルギー側であるので,遷移に関わる電子は価電子と(L-Metの場合)硫黄のL殻電子である.しかしながら,Table 1からわかるように,積分値は価電子(およびL-Met場合はL殻電子)数の総和よりも少なくなった.これは,価電子およびL殻電子が本研究で測定した範囲よりも短波長(高エネルギー)の光も吸収するために,必要な積分区間(測定範囲)をカバーできていないためであると考えられる.しかしながら,この影響を考慮すると3.5-250 eVの範囲では十分よい精度でT-R-K総和則を満たしたと結論した.すなわち,本研究で得られた吸収断面積の値は信頼性が高いと結論した.


Table 1. Number of electrons responsible to optical transitions at 3-250 eV (5-350 nm) and integration of oscillator strength distribution.




5.まとめと今後の展望

     UVSOR BL5B,BL7Bにおいて,コロジオン基板に蒸着したアミノ酸の蒸着膜を用いて,グリシン,L-アラニン,L-フェニルアラニン,L-メチオニンの4種のアミノ酸について,5-350 nm(3.5-250 eV)にわたって吸収スペクトルを測定することに成功した.
     5-350 nm(3-250 eV)という波長(エネルギー)範囲は,宇宙に比較的豊富に存在すると考えられるヘリウムI線(58.5 nm,21.2 eV)などを含んでいる.これらの電磁波をエネルギー源として用いて宇宙空間における光化学反応のシミュレーションをする際には,少なくとも4種類のアミノ酸については光化学反応を定量的に扱うことが,本研究の成果によって可能となった.また,他の生体アミノ酸やDNA,RNA塩基についても同様の吸収スペクトル測定を進めており,新たな成果を学術講演会などでご紹介することができるであろう.
     加えて,今以上の高エネルギー領域へ測定範囲を広げるべくUVSOR BL1Aなどで新たな実験を進めている.今回の測定範囲よりも短波長(高エネルギー)の領域では,生体分子を構成する軽元素のK殻電子を選択的に励起するエネルギー領域に入る.これらの領域の光子のエネルギーは数百 eV以上であり,VUV領域とは異なる反応が確認できるかもしれない.また,これらの測定に成功すれば,軟X線とアミノ酸との相互作用だけでなく,冒頭で述べた光学近似[12]に基づいて高速荷電粒子とアミノ酸との相互作用までも定量的に議論することができるようになるであろう.
     真空紫外線および軟X線領域における生体分子の吸収スペクトルの測定は,一見すると生命の起源の研究を進めていく上では遠回りにも思われる.しかしながら,生体分子の基本的な物理的性質に関する情報を得ることは,生命の起源研究をはじめとする様々な研究に大きな波及効果を与えるものである.われわれのグループの研究成果は基礎的な測定が科学の進歩において不可欠であることを示すものであり,新たな物理的性質に関する研究や,本研究の成果を利用し展開するきっかけになることを期待したい.

謝辞

     本稿で紹介した研究は,中川研究室の卒業生である蒲原真澄さんを中心に行われました.蒲原真澄さんに感謝いたします.吸収スペクトルの測定は,自然科学研究機構・分子科学研究所UVSORの共同施設利用(課題番号18-515,18-534)において行われました.UVSORスタッフの皆様に感謝いたします.また,原稿執筆に際し,さまざまな有益なコメントをいただいた大阪府立大学の川村邦男先生に深くお礼申し上げます.最後に,第33回生命の起原および進化学会学術講演会参加のための旅費援助をいただいた生命の起原および進化学会の皆様に深く感謝いたします.

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