Influence of 20 common amino acids on the template-directed formation of oligoguanylate from guanosine 5'-monophosphate 2-methylimidazolide on a polycytidylic acid template

Kunio Kawamura * and Kazuhiro Kuranoue

Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Osaka Prefecture University
Gakuen-cho 1-1, Sakai, Osaka 599-8531, Japan
Fax: 072-254-9903;
E-mail: kawamura@chem.osakafu-u.ac.jp

(Received 12 June, 2003 Accepted 20 June, 2003)

(Abstract)

The influence of 20 common amino acids for the template-directed formation of oligoguanylate (oligo(G)) from guanosine 5ユ-monophosphorimidazolide (2-MeImpG) on a polycytidylic acid (poly(C)) template (TD reaction) has been inspected for the first time. The yields of oligo(G) were analyzed at 3 and 7 d and it showed less inhibitory activity of the amino acids to the TD reaction while the yields of oligo(G) decreased with His and Tyr. His inhibited the TD reaction, in which 2-MeImpG disappeared rapidly and the formation of oligo(G) was fairly reduced compared with using other amino acids. It was found that the disappearance of 2-MeImpG in the absence of poly(C) was accelerated by His so that the inhibition of the TD reaction with His is due to the acceleration of the hydrolysis of 2-MeImpG. The acceleration of the hydrolysis of 2-MeImpG occurred either in the presence of L-His or D-His, where the hydrolysis of 2-MeImpG was consistent with pseudo-second order process. On the other hand, a mixture of the 20 common amino acids with some transition metal ions showed somewhat strong inhibition to the TD reaction. Based on the results, the relationship of the chemical evolution between nucleic acids and amino acids are going to be discussed.

(Keyword) chemical evolution of RNA, amino acid, transition metal, RNA world, template-directed formation of oligoguanylate, nucleoside 5'-phophorimidazolide, relationship between nucleic acid and amino acid

オリゴグアニル酸の鋳型指示生成反応に対する生体アミノ酸の影響

川村邦男*,蔵之上和博

大阪府立大学大学院工学研究科応用化学分野
〒599-8531大阪府堺市学園町1-1
Fax: 072-254-9903; Email:: kawamura@chem.osakafu-u.ac.jp


要旨

ポリシチジル酸鋳型(poly(C))存在下におけるグアノシン5'-モノリン酸2-メチルイミダゾリド(2-MeImpG)からのオリゴグアニル酸(oligo(G))の生成反応(鋳型指示反応)に対する20種類の生体必須アミノ酸の影響を初めて調査した.oligo(G)の生成量を3ないし7日間後に分析した結果,L-HisとL-Tyrを加えた場合に生成率は減少したが他のアミノ酸はあまり影響を与えなかった.鋳型指示反応にL-Hisを添加した場合には2-MeImpGが急速に減少しoligo(G)の生成が減少した.また,poly(C)が存在しない条件下での2-MeImpGの減少速度もL-Hisによって加速されることを見いだし,従って鋳型指示反応のHisによる阻害効果は2-MeImpGの加水分解の促進による.2-MeImpGの加水分解の促進はL-HisとD-Hisのどちらでも観測されたが,この反応はおおむね2次反応に従った.一方,種々の遷移金属イオンとアミノ酸とを含む溶液中では鋳型指示反応はかなり阻害された.以上の結果に基づいて核酸とアミノ酸の化学進化の関係について考察した.

1.緒言

RNAは生体中で遺伝情報を保持するとともに酵素機能を発現するので,生命らしい性質を持った最初の化学反応系はRNA分子の集団から構成されていたと考えられている[1].このRNAワールド仮説を検証するために,原始地球環境を模した実験条件下でRNAの化学進化過程が研究されてきた[2-5].しかし,これらの実験が原始地球環境のモデルとして妥当かどうかということを吟味するならば,用いられたモデル反応はタンパク質,脂質あるいは糖などを含まずもっぱらRNAだけからなる系であったという問題がある.しかもRNAワールド仮説が正しいとしても,生命の起原となった化学反応系が純粋にRNA分子だけから構成されていたことをRNAワールド仮説は意味するものではない.その理由は以下のようにまとめられるであろう.第1に,RNAワールドの形成に対して他の分子が関与したと考えることはRNAワールド仮説とは対立しない.なぜなら,最初の生命的な化学反応ネットワークにおいて情報保持機能をもつ分子と酵素機能を持つ分子との対応付けがRNA分子によってなされたことがRNAワールド仮説の核心であって, RNAワールドの中核をなす反応系に対する他の物質群の関与の有無と仕方は付随的な問題であると考えられるからである.第2に,現在の生体中では核酸とタンパク質は互いに役割を分担し協調して働く.また試験管内人工ウイルスの概念によると,ウイルス型のシステムは遺伝子型のRNA分子が表現型のタンパク質と結合して構成されているものと位置づけられた[6].このウイルス型システムはRNAワールド型システムの後に出現し,細胞型へ発展するための橋渡しの役割をしたと推測された.このように原始的なシステムから現在のシステムへの発展を考えると,RNAとタンパク質状物質は化学進化の初期の段階から関わりがあって,その背景の上に現在のような核酸とタンパク質との関係に至ったと考えることが自然である.
    このような考え方に基づくと,核酸の前生物的な生成モデル反応においてタンパク質などの様々な分子の関与を調べることは興味深い課題である.そこで我々は原始地球環境下で生成し得たアミノ酸やタンパク質状物質について,核酸の非生物的な生成反応と分解反応に対する作用について研究を開始した[7,8].取りかかりとして遊離のアミノ酸の影響について系統的に調べる必要があるが,今日まで行われていなかった.ここで,原始地球環境においてアミノ酸は核酸よりもできやすかったと見なすことは,これまでの化学進化実験の結果から見て妥当であろう.従って,核酸が化学進化した過程でアミノ酸が共存した可能性は充分考慮に値する.このような背景から本研究では,前生物的なRNAポリメラーゼ反応のモデルであるオリゴグアニル酸の鋳型指示生成反応に対して,20種類の生体必須アミノ酸の影響を調べた.その結果,L-およびD-Hisは鋳型指示反応を強く阻害することを見いだした.しかし,他のアミノ酸は鋳型指示反応に対してあまり影響を与えなかった.また種々のアミノ酸と金属イオンとを含む原始海水モデルを調製しこの影響を調べた結果,この系でも鋳型指示反応がかなり強く阻害されることを見いだした.これらの結果に基づいて,核酸の化学進化に対するアミノ酸の関わりについて考察する.

2.実験

2−1 試薬と装置

グアノシン5'-モノリン酸2-メチルイミダゾリド(2-MeImpG)はJoyceらの方法に従って合成した(純度95%)[9].ポリシチジル酸(poly(C))はSIGMA社製,アミノ酸は和光純薬社製のものを用いた.海塩はクロス社製のものを用いた.その他の試薬は特級品を用いた.

2−2 鋳型指示反応によるオリゴグアニル酸の生成

鋳型指示反応は,0.015 M 2-MeImpG, 0.025 M poly(C), 1 M NaCl, 0.2 M MgCl2, 0.1 M 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonic acid (HEPES)(pH 8.0),およびアミノ酸を含む溶液中で25℃で行った.アミノ酸は特にことわらない限りL体を用いた.これらの反応溶液の一部を72 hおよび168 h後に採取し,ただちに液体窒素中で凍結し反応を停止した.試料中のpoly(C)鋳型はリボヌクレアーゼAを用いて(6000 unit/100 mL,18 h,37 ℃)分解した.これらの試料を陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー(AE-HPLC)および逆相分配HPLC(RP-HPLC)で分析し,試料中のグアニル酸成分の組成を調べた.

2−3 アミノ酸と金属イオンの混合物を含む系での反応

アミノ酸と金属イオンを含む溶液として,0.1 M L-Ser, 0.08 M L-Ala, 0.06 M L-Val, 0.013 M L-Leu. 0.02 M L-Ile, 0.027 M L-Pro, 0.02 M L-Phe, 0.027 M L-Met, 0.02 M Gly, 0.067 M L-Thr, 0.053 M L-Cys, 0.04 M L-Tyr, 0.06 M L-Asn, 0.047 M L-Gln, 0.04 M L-Asp, 0.033 M L-Glu, 0.067 M L-Lys, 0.027 M L-Arg, 0.027 M L-His, 0.01 M NaCl, 0.01 M MgCl2, 0.01 M CaCl2, 0.01 M KH2PO4, 0.001 M NiCl2, 0.001 M CuCl2, 0.001 M FeCl3, 0.001 M CoCl2, 0.001 M Zn(NO3)2, 0.001 M MnCl2, 0.001 M AlCl3, 0.001 M H2MoO4, 0.001 M PbCl2 (pH = 7.0)を含む溶液を調製した(モデル混合物1).この溶液の一部をアミノ酸混合物として鋳型指示反応に添加した.一方,この溶液をオートクレーブ中で6 h,250℃,N2分圧45 kg cm-2で加熱したもの(モデル混合物2)を同様にして添加して影響を調べた[10].また金属イオンをそれぞれ単独で0.1 mM含む条件下で鋳型指示反応の影響を調べた.

2−4 HPLC分析

AE-HPLCは島津LC10AシステムにDNA-NPRカラム(東ソー)を用い,NaCl濃度0.3 M(t = 0)から1.5 M(70 min)(pH 11,0.01 M tris(hydroxymethyl)aminomethane)の範囲で直線グラジエントをかけ,流速0.75 mL/minカラム温度35℃で分析した.RP-HPLCはODS-2カラム(GLサイエンス社製)を用いてA: 0.005 M NaH2PO4(pH 3.5)およびB: 0.01 M NaH2PO4(40 % CH3OH,pH 4.0)を含む溶離液を用いてBの割合が0%(t = 0),40%(t = 30 min),100%(t = 4 5min)となるようにSCL-10Aコントローラの2番の曲線グラジエントを用いて流速1 mL/min,カラム温度35℃で分析した.検出はどちらの場合も253 nmで行った. AE-HPLC上では生成物はoligo(G)の鎖長の短いものから溶出するが,モノマー成分としてグアノシン5'-モノリン酸(pG),2-MeImpG,P1,P2-bis(5'-guanosyl) diphosphate (G5'ppG),およびシチジン3'-モノリン酸(C3'p)が1つのピークとして溶出する.これらのモノマー成分はRP-HPLCを用いてさらに分離分析し各成分の割合を決定した. 上述のアミノ酸混合物(モデル混合物1)を加熱した生成物(モデル混合物2)の分子量をサイズ排除ゲルクロマトグラフィー(GPC)で測定した.ゲル濾過カラム(TSKgel G2000SWXL)に溶離液として0.05 M NaH2PO4,0.3 M NaCl(pH = 7.0)を用いて,流速1.0 mL/min,カラム温度25℃,検出波長220 nmで分析した.生成物の分子量はタンパク質マーカーを用いて分子量と保持時間との関係を調べてこの関係から算出した.

3.結果および考察

3−1 鋳型指示反応に対するアミノ酸の影響

鋳型指示反応は以下の式で表すことができる.
pG*

pG(1)
pG+pG*(pG)2(2-2)
(pG)2+pG*(pG)3(2-3)
. . .
(pG)n-1+pG*(pG)n(2-n)
ここでpG*は2-MeImpG,(pG)iは鎖長i(i = 2 - n)のoligo(G)を表す.式(1)は2-MeImpGの加水分解反応を,また式((2-2) ミ (2-n))はoligo(G)の伸長反応を示す.また副反応として微量のG5'ppGが生成する[3].既存の研究結果と同様にこれらの反応が進行したことをHPLCチャートで確認し,20種類の生体必須アミノ酸をそれぞれ単独で添加して鋳型指示反応に対する影響を調べた.活性化ヌクレオチドモノマーとして2-MeImpGを選んだ理由は,ImpGではZn2+あるいはPb2+を共存しないと反応効率はあまり高くなく[11],グアノシン5'-モノリン酸イミダゾリド(ImpG)を用いてアミノ酸の影響を調べると結果の解釈が複雑になると予測されたためである[3].これらの実験を探索として妥当なものとするために,アミノ酸の濃度は2-MeImpG濃度に匹敵する0.01 Mとした.HPLCを用いてpG,2-MeImpG,G5'ppG,およびoligo(G)を分析し生成量を明らかにした(Table 1).

Table 1. Yields (%) of oligo(G) in the presence of several amino acids.a
amino acid pG 2-MeImpG G5'ppG(pG)2(pG)3(pG)4(pG)5+
3 d
Noneb36.734.00.87.32.42.116.6
Gly41.127.90.86.82.62.318.5
L-Ala 43.8 32.7 1.0 5.0 1.8 1.5 14.1
L-Val 39.2 32.8 0.8 5.8 2.3 2.1 17.1
L-Leu 40.5 33.0 0.8 4.9 2.2 1.9 16.5
L-Ile 32.7 27.8 0.6 8.3 3.2 2.8 24.6
L-Met 42.6 33.6 0.9 4.5 2.0 1.7 14.6
L-Trp 40.0 39.4 0.9 4.0 1.6 1.4 12.8
L-Phe 37.8 30.4 0.9 6.1 2.5 2.2 20.1
L-Pro 39.5 26.8 0.8 5.6 2.8 2.8 21.8
L-Asn 38.6 33.1 1.0 6.0 2.3 1.9 17.1
L-Gln 39.7 37.0 1.1 6.0 2.1 1.6 12.6
L-Ser 36.3 29.8 0.9 6.6 2.6 2.5 21.3
L-Thr 39.6 31.7 0.0 5.7 2.5 2.1 18.4
L-Tyr 44.7 39.2 0.6 1.6 1.1 1.2 11.6
L-Cys 41.9 33.2 1.2 7.1 2.2 1.9 12.5
L-Asp 41.2 33.7 1.3 6.4 2.2 1.5 13.8
L-Glu 40.9 28.2 1.2 4.8 2.6 2.6 19.7
L-Lys 38.5 31.8 1.2 8.4 2.4 2.3 15.5
L-Arg 42.2 35.6 0.6 2.6 1.6 1.7 15.6
L-His 74.2 12.4 0.8 0.9 1.5 1.6 8.5
L-Hisc 97.2 1.7 1.1 0.0 0.0 0.0 0.0
D-Hisd 69.8 22.6 1.9 0.4 0.7 0.8 3.8
7 d
Noneb 55.0 10.8 1.7 9.1 3.1 2.6 17.7
Gly 58.2 10.9 1.6 7.6 2.2 1.9 17.7
L-Ala 60.9 13.7 2.0 5.5 2.3 1.8 13.8
L-Val 50.0 12.6 1.5 6.5 2.5 2.5 24.5
L-Leu 56.2 14.7 1.6 5.7 2.4 2.0 17.3
L-Ile 57.4 15.2 1.3 5.0 2.2 2.1 16.7
L-Met 61.0 15.6 1.7 6.7 2.7 1.8 10.5
L-Trp 55.7 22.0 1.7 4.5 1.8 1.4 12.9
L-Phe 56.1 13.7 2.0 7.1 2.7 2.1 16.3
L-Pro 54.9 13.4 1.3 5.5 2.9 2.4 19.6
L-Asn 55.7 14.8 1.9 6.6 2.5 2.0 16.5
L-Gln 54.0 20.1 1.8 5.6 2.3 1.8 14.3
L-Ser 59.6 15.4 1.8 5.4 1.8 1.5 14.5
L-Thr 52.6 13.1 0.0 7.1 2.9 2.6 21.7
L-Tyr 66.0 17.6 1.5 2.7 1.5 1.2 9.6
L-Cys 52.6 11.8 2.0 8.1 3.4 2.6 19.5
L-Asp 50.1 12.1 2.1 9.6 3.6 2.4 20.1
L-Glu 56.5 12.4 2.2 6.7 3.3 2.4 16.4
L-Lys 52.8 12.3 1.9 7.6 2.9 2.0 20.6
L-Arg 56.4 14.9 1.2 4.2 2.2 2.2 18.9
L-His 80.6 5.9 2.3 1.4 1.6 1.4 6.8
Reaction conditions: [2-MeImpG] = 0.015 M, [poly(C)] = 0.025 M, [L-amino acid] = 0.01 M, [NaCl] = 1.0 M, [MgCl2] = 0.2 M, [HEPES] = 0.1 M, pH = 8.0, 25℃, 3 or 7 d.
a The percentages are the uncorrected HPLC readings.
b Amino acid was not added.
c 0.05 M L-His was added.
d 0.01 M D-His was added.

この結果から oligo(G)の生成量はL-Hisを加えた場合にかなり減少し,またL-Tyrを加えた場合にも少し減少した.これらのHPLCチャートの一例をFig. 1に示す.HPLCチャートを比較するとHisあるいはL-Tyrの影響が分かりやすい.全般的にはL-HisやL-Tyr以外のアミノ酸はこの鋳型指示反応にあまり影響を与えなかった.またTable 1の結果はG5'ppGの生成量は変化しないことを示している.さらにHPLCにおいてG5'ppGを末端に持つoligo(G)(G5'p(pG)n)はG5'ppGを末端に持たない(pG)n型のoligo(G)ピークよりも少し遅く溶出するが,これらのピークの増減も認められなかった.これは我々の予備的な研究において見いだされたアミノ酸熱重合物の鋳型指示反応に対する効果と異なる[7].

Figure 1. HPLC profiles of oligo(G) products of the template-directed reaction from 2-MeImpG on a poly(C) template in the presence of amino acids.
[2-MeImpG] = 0.015 M, [poly(C)] = 0.025 M, [NaCl] = 1.0 M, [MgCl2] = 0.2 M, [HEPES] = 0.1 M, [amino acids] = 0 - 0.03 M, pH = 8.0, 25 ℃, 7 d.
Top left: no amino acid was added.
Top right: 0.01 M L-Tyr was added.
Bottom left: 0.01 M L-His was added.
Bottom right: 0.03 M L-His was added.
これらのアミノ酸はL体であるが,L-HisのかわりにD-Hisを用いてもoligo(G)の生成効率は減少した(Table 1).またL-His濃度を0.05 Mまで増加するとその影響は顕著になった.L-Hisを加えない場合を基準にしたときのoligo(G)の生成率(2-mer以上の合計)とL-His濃度との関係をFig. 2に示す.

Figure 2. The relative yield of oligo(G)s vs. the L-histidine concentration.
[2-MeImpG] = 0.015 M, [poly(C)] = 0.025 M, [NaCl] = 1.0 M, [MgCl2] = 0.2 M, [HEPES] = 0.1 M, [L-histidine] = 0 - 0.05 M, pH = 8.0, 25 ℃, 7 d.

Table 1によると,Hisを添加した系ではoligo(G)の生成率が減少すると同時に2-MeImpGの残存率が他の場合と比べて小さい.このことは,His存在下でoligo(G)の生成率が減少する効果は,2-MeImpGの分解が促進されたためであることを示唆している.この推測が妥当かどうかを確かめるために,2-MeImpGの加水分解反応をpoly(C)を加えない条件下で追跡した.2-MeImpGの加水分解反応の反応曲線を調べた結果,0.01 MのHis存在下では2-MeImpGの半減期は7〜11倍減少した(Fig. 3a).活性化ヌクレオチドの加水分解反応のこれまでの研究では,イミダゾールなどによってこの反応が促進されることは知られていなかった [12].また2-MeImpGやImpGが加水分解するとイミダゾールが脱離するので,イミダゾ−ルに触媒作用がある場合にはこの加水分解反応は1次に従わないはずであるが,これまでの研究では活性化ヌクレオチドの加水分解反応は1次反応に従うことが何度も確かめられた[12].加水分解反応による2-MeImpGの減少を1次プロットすると,Hisを添加した場合には1次プロットからはずれてくる (Fig. 3b).試みとして2次プロットしたが1次プロットよりもよい直線関係となった(Fig. 3c).



Figure 3. The reaction curves (a), first-order rate plots (b), and second-order rate plots (c) of the disappearance of 2-MeImpG without a poly(C) template. [2-MeImpG] = 0.015 M, [NaCl] = 1.0 M, [MgCl2] = 0.2 M, [HEPES] = 0.1 M, pH = 8.0, 25 ℃. ○: no histidine, □: [L-His] = 0.01 M, ■: [D-His] = 0.01 M.

この事実は, 2-MeImpGの加水分解反応はHisの存在下では2次反応で進行する経路を含むことを示唆する.以上のように,イミダゾールを部分構造として持つヒスチジンの共存下で活性化ヌクレオチドの加水分解反応が促進され,かつ,その反応が2次反応に従うことは予想外の発見であった.このメカニズムは,例えばアデノシン5'-トリリン酸(5'-ATP)の加水分解反応が金属イオンの存在下で2次反応で進行する場合の機構と類似しているかも知れない[13].5'-ATPの加水分解反応では,2分子の5'-ATPを含む金属錯体が生成しこれが加水分解活性を持つことによって,2次反応に従うと結論された.従って, 2-MeImpGの加水分解反応が2次反応で進行する機構はこのようなモデルと類似しているかも知れないが,どのようにHisが関与するのかなどについては今後の研究が必要である.

3−2 アミノ酸と金属イオン混合物の影響

一方,アミノ酸と金属イオンを含む混合溶液(モデル混合物1および2)を鋳型指示反応に添加した系での生成物の割合を調べた.ここで用いたアミノ酸の組成は牛リボヌクレアーゼの組成に比例するものであるが,Trp以外のアミノ酸を含んでおりモデルとして適当であると考えられる.その結果,モデル混合物1を添加すると反応が阻害された(Fig. 4, Table 2).

Figure 4. HPLC profiles of oligo(G) products of the template-directed reaction from 2-MeImpG on a poly(C) template in the presence of mixtures of amino acids and metal ions. [2-MeImpG] = 0.015 M, [poly(C)] = 0.025 M, [NaCl] = 1.0 M, [MgCl2] = 0.2 M, [HEPES] = 0.1 M, [amino acids (monomer unit)] = 0.2 M, pH = 8.0, 25 ℃, 7d.
Amino acid mixture was added to the template-directed reaction; AAMX: amino acid mixture without heated; Total concentration of amino acids: 0.02 M; Amino acid ratio: Ala (12), Val(9), Leu(2), Ile(3), Pro(4), Phe (3), Trp (0), Met (4), Gly (3), Ser (15), Thr (10), Cys (8), Tyr (6), Asn (9), Gln (7), Asp (6), Glu (5), Lys (10), Arg (4), His (4); Metal ions: Ca2+, K+: 0.24 mM; Mn2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Pb2+, MoO42-: 0.024 mM. AAMX-H inculdes exactly the same mixture of amino acids and metal ions as AAMX, but heated for 6 h under 45 kg cm-2 N2 at 250 ℃. Molecular weight of AAMX-H was determined to be 11400 - 13500 by GPC.
Left: AAMX was added.
Right: AAMX-H was added.

Table 2. Yields (%) of oligo(G) by the template-directed reaction in the presence of mixtures of amino acids, individual metal ion, and sea salt.a
AdditivepG2-MeImpGG5'ppG(pG)2(pG)3(pG)4(pG)5+
None 55.0 10.81.79.1 3.12.617.7
AAMXb68.6 9.0 1.96.42.11.9 10.1
AAMX-Hc75.5 6.61.73.81.3 1.6 9.5
AAMXd82.3 10.2 2.2 0.2 0.9 0.9 3.3
AAMX-Hd88.111.1 0.8 0.0 0.00.0 0.0

Zne 68.1 7.9 1.6 3.72.32.0 14.4
Cue 72.9 9.0 1.4 2.7 1.8 1.5 10.7
Fee 67.4 9.8 1.7 3.9 2.0 1.7 13.5
Nie 69.6 8.1 1.8 3.8 1.9 1.7 13.2
Coe 68.0 9.3 1.8 3.9 2.0 1.7 13.4
Mne 67.6 9.3 1.8 4.0 2.0 1.7 13.5
Ale 66.3 9.2 1.8 4.2 2.1 1.9 14.4
Pbe 68.5 7.9 2.0 2.2 2.0 1.7 15.7
Moe 71.3 8.0 1.8 4.2 1.9 1.7 11.1

Nonef68.5 7.1 8.02.8 3.54.3 5.9
Sea Saltf,g82.9 2.99.02.9 1.30.70.3
Reaction conditions: [2-MeImpG] = 0.015 M, [poly(C)] = 0.025 M, [NaCl] = 1.0 M, [MgCl2] = 0.2 M, [HEPES] = 0.1 M, pH = 8.0, 25 ℃, 7 d.
a The percentages are the uncorrected HPLC readings.
b Amino acid mixture was added to the template-directed reaction; AAMX: amino acid mixture without heated; Total concentration of amino acids: 0.02 M; Amino acid ratio: Ala (12), Val(9), Leu(2), Ile(3), Pro(4), Phe (3), Trp (0), Met (4), Gly (3), Ser (15), Thr (10), Cys (8), Tyr (6), Asn (9), Gln (7), Asp (6), Glu (5), Lys (10), Arg (4), His (4); Metal ions: Ca2+, K+: 0.24 mM; Mn2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Pb2+, MoO42-: 0.024 mM.
c AAMX-H inculdes exactly the same mixture of amino acids and metal ions as AAMX, but heated for 6 h under 45 kg cm-2 N2 at 250 ℃. Molecular weight of AAMX-H was determined to be 11400 - 13500 by GPC.
d 10 times amount of AAMX or AAMX-H was added to the template-directed reaction.
e 0.1 mM metal ion was added to the template-directed reaction.
f pH = 7.5.
g Sea salt was added at 3.5 % instead of NaCl and MgCl2


また,この混合溶液を250℃で加熱したものを添加した場合にも同様の傾向であったが,oligo(G)の生成率はより低下した.これらの混合溶液中にはL-HisやL-Tyrが含まれるのでそれらの効果が現れたとも考えられるが, この実験下でのL-HisやL-Tyrの濃度は実際にはあまり高くない.例えば,アミノ酸の総濃度が0.2 M(Table 2)の実験条件下でのL-Hisの相当濃度は6.5 mMで,0.02 Mのときは0.65 mMである.これらの濃度は単独でL-Hisを添加した場合(Table 1, Fig. 1)よりもかなり低いが,鋳型指示反応はかなり強く阻害された.また2-MeImpGの残存量は,L-Hisを単独で加えた場合と比べて比較的大きい.すなわち,いったん生成したoligo(G)が加水分解したか,あるいはoligo(G)の生成反応を阻害したためにoligo(G)の生成量が減少したものと考えられる.
一方,金属イオンもモデル混合物に含まれるので,鋳型指示反応において遷移金属イオンを単独で添加してその影響を調べた(Table 2).モデル混合物中のそれぞれの遷移金属イオンの濃度は,アミノ酸の総濃度が0.2 Mのときは0.24 mMに相当し0.02 Mのときは0.024 mMである.そこで0.1 mMの金属イオンを添加し鋳型指示反応に対する影響を調べたが,これらの金属イオンをそれぞれ単独で添加した場合にはわずかに弱い阻害効果が認められた.従って,モデル混合物1で,強い阻害効果が現れた理由の一因としてこれらの金属イオンの影響があると考えられる.ここで補足として海塩を共存させて鋳型指示反応を試みた結果,鋳型指示反応の効率は下がった.これまでの研究でMgCl2濃度が高くなると鋳型指示反応の効率が増加することが知られているので,海塩を加えてoligo(G)生成率が低下した一因は,海塩中のMgCl2濃度がモデル条件よりも低かったことによると推定される.
一方,加熱処理を行ったモデル混合物2ではモデル混合物1と比べて阻害効果が大きかったが,これは加熱によってアミノ酸が熱重合しタンパク質状の物質が生成しこれがより大きな阻害効果を持ったことを示唆している.過去のこの種の研究において,アミノ酸は熱水中で重合しタンパク質状物質が生成することが確認された[10].そこで加熱後の生成物の分子量分布をゲルクロマトグラフィーで測定したところ,加熱によって生成した物質の分子量は11400〜13500であった.このことは,アミノ酸が重合した成分が鋳型指示反応をより阻害した可能性を示唆している.ところで,0.2 Mのモデル混合物2を添加した場合にもモデル混合物1と同様に,2-MeImpGの残存濃度が他の場合と比べて高い.従って,これらのモデル混合物の効果は上述のHis単独の効果とは異なり,生成したoligo(G)を加水分解したあるいは鋳型指示反応による重合過程を阻害する機構が含まれることを示唆する.

3−3 RNAの化学進化とアミノ酸との関係に関する考察

アミノ酸の鋳型指示反応に対する影響をまとめると,①アミノ酸単独ではほとんど鋳型指示反応に対して影響を与えなかった,②Hisは鋳型指示反応を阻害した,③アミノ酸と金属イオンの混合系では鋳型指示反応を阻害した,である.これらの事実をRNAの化学進化と矛盾なく考察するのは困難なので,以下に考察の内容を断片的にまとめる.第1に,ありふれたアミノ酸を用いたのにも関わらず単独では鋳型指示反応に対してほとんど影響を与えなかったことは,化学進化において単独のアミノ酸は核酸との間には強い相互関係がなかったことを示唆している.逆に,アミノ酸がRNAの生成や分解に対して強い影響を与える系は,酵素系の発展に対する障害となったであろう.その理由は,酵素は対象とする反応を酵素がないときと比べて格段に促進しなければならず[8,14],アミノ酸とタンパク質状物質が共存する系でアミノ酸に触媒作用がある場合にはタンパク質状物質の触媒作用は相対的に発現されにくくなると予測されるからである.本研究の結果は,RNAの生成に対するバックグラウンド反応の速度に対してアミノ酸はほとんど影響しないことを示しているので,アミノ酸からタンパク質状物質が生成し,RNAの生成に対する酵素機能が自発的に出現しやすい条件の1つを満たしていると考えられる.一方Hisではかなり強い阻害作用が認められたが,鋳型指示反応においてHisの阻害作用がどのように抑制されたのかについてさらに検討が必要である.
第2は,アミノ酸と金属イオンの混合物あるいは海塩を加えた場合に,鋳型指示反応の効率がかなり低下したことについてである.上述したようにアミノ酸単独では鋳型指示反応に対する阻害効果はあまりなかったが,混合系では強い阻害効果を示した.核酸の化学進化の原始地球環境として,アミノ酸は混合物として存在したとする方が適当であると考えられるが,このような条件下で鋳型指示反応の効率がかなり低下したということはアミノ酸や金属イオンの混合物は鋳型指示反応にとって有害であったことを示しているかも知れない.また,この種のアミノ酸と金属イオンとの混合系は鋳型指示反応だけでなく様々な反応に対する触媒作用を持っているかも知れない.付け加えて,熱水中で処理したアミノ酸と金属イオンとの混合物を加えた場合に,鋳型指示反応の効率はさらに低くなった.これは,RNAワールド仮説と熱水起原説とが相反する実験結果であるかも知れないが,今後さらに検討が必要である.

4.まとめ

本研究では,核酸の代表的な原始ポリメラーゼモデルである鋳型指示反応に対する種々のアミノ酸の影響を調べた.その結果ヒスチジンは活性化ヌクレオチドの加水分解を促進することによって鋳型指示反応を強く阻害した.その他のアミノ酸は鋳型指示反応に対してほとんど影響を与えなかった.また,種々のアミノ酸と金属イオンを含む混合溶液中では鋳型指示反応はかなり強く阻害された.
この研究で試験したアミノ酸を含む条件はこれまで調べられてきた条件よりも原始地球環境により近いと考えられるので,RNAの現実的な化学進化を考察する上で役に立つものと考えられる.アミノ酸と核酸の化学進化の相互関係について明らかにしてRNAの化学進化の全体像を描くためには,より広範な条件下で核酸の化学進化について実験を積み重ねこれまでに行われてきた化学進化実験のモデルとしての妥当性を検証しなければならない.

5.謝辞

本研究は日本学術振興会科学研究費補助金の援助を得た(15550150).海塩を添加する実験では長濱稔修士に協力していただいた.

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