PHYSIOLOGICAL FUNCTIONS OF FREE D-ALANINE IN AQUATIC INVERTEBRATES

Hiroki Abe and Naoko Yoshikawa
Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
Bunkyo, Tokyo 113-8657, Japan
FAX: 03-5841-8166
E-mail aabe@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

Abstract

Several free D-amino acids, which were thought not to exist in eukaryotes, have recently been detected in various aquatic invertebrates. In particular, free D-alanine was found in large amount (3-50 mmol/g wet wt.) in the tissues of several crustaceans and bivalve mollusks. Under high salinity stress, these animals largely accumulate D- and L-alanine irrespective of species, together with several other non-essential L-amino acids of which increases are species dependent. In these species, D-alanine is proven to be one of the major compatible osmolytes responsible for the intracellular isosmotic regulation or cell volume regulation. D-Alanine is also accumulated with L-alanine and inorganic ions in the tissues of Japanese mitten crab Eriocheir japonicus during gonadal maturation in the river and during spawning downstream migration toward the sea. Under hypoxia stress, red swamp crayfish Procambarus clarkii increased D- and L-alanine in muscle and hepatopancreas in addition to the increase of lactate. The increase is much higher in seawater than in freshwater. Thus, D- and L-alanine are possible to be anaerobic end products during prolonged hypoxia of this species and other invertebrates. Alanine racemase [EC 5.1.1.1] has been proven to catalyze the interconversion of D- and L-alanine in crustaceans and bivalve mollusks and purified from two crustacean species and a mollusk. The enzyme isolated from the muscle of black tiger prawn Penaeus monodon is a dimer having molecular mass of 90 kDa. Several partial amino acid sequences of peptide fragments obtained from the isolated enzyme showed positive homologies from 52 to 76% (identity from 31 to 45%) with bacterial counterparts and a catalytic tyrosine residue of the bacterial enzyme was also retained in the prawn one, indicating that alanine racemase gene is well conserved from bacteria to invertebrates.

(Key Words) alanine racemase, D-alanine, D-amino acid, hypoxia, invertebrate, isosmotic regulation, metabolism, physiological role

水生無脊椎動物における遊離D-アラニンの生理機能

阿部宏喜・吉川尚子
東京大学大学院農学生命科学研究科水圏生物科学専攻
〒113-8657 東京都文京区弥生1-1-1
FAX: 03-5841-8166
E-mail:aabe@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

1. はじめに

 生物体を構成するアミノ酸はすべてL型であると考えられてきたが,分析法の進歩に伴ってこの20年ほどの間に哺乳類を含む多くの生物種に遊離のD-アミノ酸が存在することが明らかになり,その生理機能には多大な興味がもたれている.なかでも,水生無脊椎動物では種により筋肉部に多量のD-アラニンあるいはD-アスパラギン酸を含有することが知られてきている.水生無脊椎動物におけるD-アミノ酸の発見は意外に古く,1977年にマダコOctopus vulgarisにD-アスパラギン酸が初めて見いだされ[1],1980年には数種エビ・カニ類筋肉にD-アラニンが[2],また1984年にはヤマトシジミCorbicula japonica等数種二枚貝の筋肉にD-アラニンが発見され,ヤマトシジミにはアラニンラセマーゼ活性も検出されている[3].90年代にはいると高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いる光学分割法が考案され,D-, L-アミノ酸の分析は容易になった.筆者ら[4] は(+)-1-(9-フルオレニル)エチルクロロフォルメート(FLEC)でアミノ酸をプレラベルし,逆相HPLCで生体液中のすべてのD-, L-アミノ酸を分離定量する方法を開発し,微量のD-アミノ酸の分析を可能にした.本稿では筆者らのその後の成果を中心に,無脊椎動物におけるD-アラニンの生理機能について述べる.

2. 甲殻類および二枚貝におけるD-アラニンの分布

 数種甲殻類における遊離D-アラニンの分布をTable 1に示す.筋肉のみの含量を示したが,肝膵臓や神経組織にも広く分布している[4, 5].カニ類では例外なく筋肉で最も含量が高いが,エビ類では心筋や肝膵臓の方が高い場合が多い.全アラニンに占めるD-アラニンの割合は,例外はあるものの,50%を超えない.筋肉部でこの割合は一般に高い.鰓にも検出されるものの,含量は他の組織と比べると一般に少ない.D-アラニン以外にもD-アルギニンやD-アスパラギン酸などの他のD-アミノ酸も検出されるが,含量も割合も一般に低い.



 数種二枚貝におけるD-アラニンの分布をTable 2に示す.翼形亜綱 (Pterimorphia) に属するアカガイScapharca broughtonii,マガキCrassostrea gigas,ホタテガイPatinopecten yessoensisなどの組織にはD-アラニンはほとんど検出されず,初期の研究結果と一致している[3, 7].翼形亜綱の種にほとんど含まれないD-アラニンは異歯亜綱(Heterodonta)の種にはいずれも多量に含有される.筋肉部のみならず,中腸腺や鰓にも多い.特にミルクイTresus keenae水管には50 mmol/g以上存在し,D-アラニンの割合も80%以上に達する.甲殻類の場合とは異なり,異歯亜綱の二枚貝ではD-アラニンの割合が50%を超える場合が多い.これら二枚貝と他のD-アラニンの割合が低い種との間に,何らかの代謝的な差異があるのではないかと予測している.これら二枚貝にもその他のD-アミノ酸がわずかに検出されるが,量的には少ない.しかしながら,アカガイではD-アスパラギン酸含量が比較的高く(0.5-5 mmol/g),最近アスパラギン酸ラセマーゼの存在が報告されている[6, 8]. 二枚貝のD-アラニンの起源については,海水からの取り込み説,鰓の共生細菌あるいは腸内細菌起源説などいくつかの説があったが[9, 10],これら甲殻類および二枚貝にはアラニンラセマーゼが存在し,D-, L-アラニン間の相互変換を触媒している.しかしながら,上記のアカガイの例もあり,他の酵素系が存在する可能性も否定できない.その他の無脊椎動物では,ある種の環形動物[10],星口動物ホシムシ[11],ウニ生殖腺[12] などでもD-アラニンの存在が報告されている.

3. 甲殻類の浸透ストレス下におけるD-, L-アラニンの生理機能

 常に塩濃度の変化する潮間帯や汽水域に生息する水生動物にとって体内浸透圧の調節は重大な問題である.特に無脊椎動物は開放血管系であるため,血リンパ(hemolymph)中の浸透圧を一定に保つことはむずかしく,細胞内浸透環境を維持するために,容易に生合成の可能な非必須アミノ酸やベタイン類などのオスモライトを高浸透環境下で蓄積し,細胞内浸透圧を上昇させ,細胞容積を一定に保つよう進化してきた.このような調節メカニズムは細胞内等浸透調節(intracellular isosmotic regulation)と呼ばれ,1950年代から研究が行われている.グリシンやアラニンは多くの無脊椎動物種で最も有効なオスモライトとされている.
 アメリカザリガニProcambarus clarkiiを淡水から全海水まで順応させると,遊離アミノ酸総量はほぼ2倍に増加する(Fig.1).顕著に増加を示したアミノ酸はD-, L-アラニン,L-グルタミン,グリシンおよびL-プロリンで,アメリカザリガニではこれらのアミノ酸が細胞内等浸透調節のための有効なオスモライトであることがわかる.この傾向は程度の差はあれ,心筋,肝膵臓,神経組織でも同様であるが,鰓などでは認められない(Fig. 1).このような高浸透環境ストレスに応答するD-アラニンの増加は他にモクズガニEriocheir japonicus,クルマエビPenaeus japonicus,クロベンケイガニHolometopus dehaani,ケフサイソガニHemigrapsus penicillatusなどでも認められ[13, 14, 15],他のアミノ酸の増加は種によって異なるものの,D-, L-アラニンはどの種においても高浸透環境下で増加する.
 高浸透ストレス下におけるD-アラニンの増加はヤマトシジミでも確認され[3],またハマグリMeretrix lusoriaでも100から150%海水に順応させるとD-, L-Alaのみの大きな増加が見られる[6].ホシムシでは50から30%海水に塩濃度を低下させるとD-, L-アラニンは顕著に低下する[11].したがって,甲殻類のみならず,多量にD-アラニンを組織中に含有する無脊椎動物ではD-アラニンは等浸透調節のための主要なオスモライトとして働いていることは確かであろう.これはL-アラニンをD-アラニンに転換することにより,単一のオスモライトを細胞内に多量に蓄積する弊害を避ける適応と考えられる.ある低分子溶質を細胞内に多量に蓄積することは酵素作用およびタンパク質構造の制御ひいては細胞のホメオスタシスの破綻をきたすことになるからである.

Fig.1. Changes of the major free amino acids in the tissues of crayfish during acclimation from freshwater to full-strength seawater. Salinity in the rearing water was gradually increased using an artificial seawater salt mixture. After 2 days acclimation in 1/4 seawater, salinity was increased to 1/2-seawater. Salinity was then gradually increased after that up to 3/4-seawater level taking 2 days and then up to full seawater level (3.5%) taking 2 days.

4. 低酸素ストレス下におけるD-, L-アラニンの生理機能

 水生動物は陸上と比べて低酸素環境下におかれ,また水中の溶存酸素濃度は日々大きく変動している.そのため,水生動物はすぐれた低(無)酸素耐性メカニズムを発展させてきている.マガキなどの数種二枚貝では2週間にも及ぶ長期間の無酸素条件下でアラニン,アラノピン,コハク酸,プロピオン酸などの複数の嫌気最終産物を蓄積し,またグリコーゲンのグルコース単位当たりのATP収率を上げることにより,高い無酸素耐性を示すことは古くからよく知られている[16].淡水,50および75%海水に順応させたアメリカザリガニをほとんど無酸素条件下に8時間おいてダブルストレスを負荷し,その後8ないし12時間回復させると,どの条件下でも筋肉のATPは低酸素下で劇的に低下し,グリコーゲンの低下と乳酸の増加が顕著に起こる.これらは回復期にはコントロールレベルに復帰する傾向を示す.低酸素下ではD-, L-アラニンも顕著に増加し,海水中でこの増加は著しい(Fig. 2).75%海水中では回復過程でコントロールレベル近くまで低下したが,淡水および50%海水中では回復過程でもほとんど減少を示さなかった.肝膵臓でも同様なD-, L-アラニンの増加が確認されている.これまで甲殻類の嫌気最終産物は乳酸のみと考えられていたが,D-, L-アラニンも最終産物の一つとして利用しているものと考えられる.このような低酸素下におけるD-, L-アラニンの増加はハマグリ[6],環形動物Arenicola marina [17] およびホシムシSipunculus nudus[18]でも観察されており,広く無脊椎動物がD-アラニンを嫌気最終産物の一つとして利用している可能性がある.

Fig.2. Changes of D-(■) and L- (□)alanine in muscle of crayfish during anoxia (PO2< 0.1 mg/mL for 12h) and recovery (12h) in freshwater, 50% (17ppt), and 75% (25ppt) seawater. *p<0.05, **p<0.01. Refer to the legend of Fig.1 for seawater acclimitation method.

5. アラニンラセマーゼによるD-, L-アラニンの相互変換

 組織中にD-アラニンを多量に有する無脊椎動物にはD-, L-アラニン間の相互変換を触媒するアラニンラセマーゼ [EC 5.1.1.1] (ARase)が認められる.真性細菌におけるARaseはこれまで多くの種について詳細な検討が行われてきた[19].無脊椎動物におけるARaseについてはこれまで二枚貝について検討が行われていたが[3, 20, 21],最近甲殻類でもいくつかの報告がある.甲殻類ではARase活性はウシエビ,クルマエビ,コウライエビPenaeus chinensisなどの汽水種で高く,海産のミナミイセエビJasus lalandiおよび淡水種のアメリカザリガニでは低く,塩濃度変化の少ない深海産のホッコクアカエビPandalus borealisではごく弱い活性しか示さない[22].Km値はいずれも高く,組織中のD-, L-アラニン濃度をはるかに超えている.しかしながら,アメリカザリガニの海水順応過程で,筋肉でも肝膵臓でも活性は上昇し,Km値は低下し,作用しやすくなる[22].
 無脊椎動物のARaseは最初ウシエビ筋肉から部分精製され[23],最近アメリカザリガニの筋肉[24],ヤマトシジミ外套筋[25]およびウシエビの肝膵臓[26]と筋肉[27]から単離されている.真核生物では他に真菌のTolypocladium niveum[28]から単離されているに過ぎない.細菌類の酵素の一次構造は参考にならないため,酵素を単離する必要があるが,無脊椎動物のARaseは硫安および食塩溶液中では不安定で,組織中の含量が著しく少ないため精製はきわめて困難である.ウシエビ筋肉ARaseは筋肉800gから127,500倍に精製され,16%の収率で57mgの精製酵素が得られた.分子質量は90kDaの二量体と推定された.サブユニットの分子質量は44kDaで肝膵臓酵素の41kDaに近い.細菌類のARaseは40kDa内外の比較的類似したサブユニットを持つとされており[29],ヤマトシジミでも41kDaであることからARaseのサブユニットは細菌でも無脊椎動物でも類似していると考えられる.例外はザリガニの酵素で,58kDaの単量体と報告されている[24].
  無脊椎動物ARaseはきわめて高いKm値を示す.ウシエビ筋肉酵素のL-およびD-アラニンに対するKm値はそれぞれ167および179 mMと,筋肉内D-, L-アラニン含量の10倍にも達する.この点はザリガニARaseでも同様であるが,ヤマトシジミではそれぞれ22.6および9.2 mMであり,またT. niveumでもKm値は低く,真核生物でも甲殻類のみが極端に高いKm値を示すようである.しかし,最大反応速度は高く,両方向で差異は見られず,触媒効率も高い.したがって,Km値が高く,筋肉内の存在量はわずかであっても,D-, L-アラニンの相互変換を効率よく触媒できるものと考えられる.ウシエビ筋肉のARaseはD-, L-アラニンにのみ特異的で,他のアミノ酸には作用しない.
 これまで知られているARaseはすべてピリドキサール 5ユ-リン酸(PLP)を補欠分子族とする.しかしながら,無脊椎動物の酵素はPLPなしでも活性を示し,精製中PLPを添加しなくても活性のロスはない.しかしながら,PLP依存性酵素の阻害剤には細菌酵素と同様に阻害される.したがって,無脊椎動物のARaseではPLPはより強固に酵素タンパクに結合しているものと予測される.
 ウシエビ筋肉の精製酵素を断片化し,いくつかのペプチドフラグメントを精製し,シークエンスを決定した.Fig. 3に示すように,3種のペプチドは細菌類の酵素とかなり高い相同性を示した.アミノ酸同一率は31〜45%であったが,最初のペプチドフラグメントの細菌酵素との相同性はLactobacillus plantarumの酵素で58%,L. reuteで60%,Bacillus psychrosaccharolyticusで57%,B.stearothermophilusで53%およびListeria monocytogenesで52%であった.B. stearothermophilusのARaseは2つの触媒残基,すなわちリシン39およびチロシン265を持つことが知られており[29],Fig. 3に見られるようにこのチロシン残基はすべての細菌酵素およびウシエビ筋肉酵素で保存されている.したがって,ウシエビARaseも細菌類のそれと類似のメカニズムでD-, L-アラニンのラセミ化を触媒するものと予測される.第2のペプチドフラグメントはB. psychrosaccharolyticusおよびB. subtilisのARaseのほぼC末端部位に相当し,それぞれ75および76%の相同性を示した.第3のフラグメントはVibrio choleraeの推定ARaseおよびEnterococcus gallinarumのセリンラセマーゼと53%の相同性であった.これらのことから,ARase遺伝子は細菌から無脊椎動物まで比較的よく保存されていることが明らかで,無脊椎動物は前記のような生理機能にD-アラニンを利用するために,永い進化過程でこの遺伝子を保ち続けたものと考えられる.

Fig.3. Comparison of partial amino acid sequences of alanine racemase from the muscle of P. monodon to the corresponding region of that from bacteria. Amino acids identical with those of P. monodon are underlined. A catalytic tyrosine residue, which is known as tyrosine 265 in alanine racemase from B. stearothermophilus, is boxed.

6. おわりに

 以上のように,D-アラニンは多くの無脊椎動物種において重要な生理機能を果たしていることが明らかになった.これまで考えられていたように,地球上の生物はL-アミノ酸システムのみで成り立っているのではなく,明らかにD-アミノ酸システムが存在し,生命システムの維持に貢献している.このD-アミノ酸システムの研究はまだ緒についたばかりであり,今後多くのサブシステムが明らかになってくるものと考えられる.膨大な種を擁する水生無脊椎動物についてもD-アミノ酸の未知の生理機能あるいは未知の代謝経路が今後明らかにされる可能性は高い.

文 献

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